荧光原位杂交（FISH）样本玻片制备

FISH试剂

0.075M KCl                                                    （2月一次）

固定液（甲醇：冰醋酸＝3 ： 1）                    （一周一次）

2×SSC                                                          （PH=7.0,一周一次）

2×SSC 0.1%NP40                                         （PH=7.0,一周一次）

0.4*SSC 0.3%NP40                                       （PH=7.0,一周一次）

70％、85％、100％乙醇                                （一周一次）

样本玻片制备步骤

一、采集样本

1.1 外周血不少于2ml×2（WBC计数大于20×10⁹），EDTA抗凝，4℃保存小于3天

1.2 骨髓不少于1ml×2（BM增生明显活跃），肝素抗凝，保存时间小于3天，4℃保存

二、标本前期处理

2.1 .样本2500R离心8 min，让血细胞沉淀，去上清，留沉淀

2.2 沉淀+ 0.075M KCl混合（1ml样本 ＋ 8ml KCl），吸管吹匀，水浴箱37℃低渗 30 min

2.3 取出按样本：固定液＝10：1比例加固定液，固定液不的超过1 ml

2.4 混匀，吹散细胞，1800R 离心 8 min

2.5 去上清，留沉淀，加5～10ml 固定液（不得超过10ml），混匀，静置10 min（吸去底部絮状沉淀）

2.6 重复2.4～2.5步骤2次，（外周血2洗3次，骨髓3～4次）

2.7 去上清液，加少许固定液1～2min 4℃保存1～2月（保存样本）

三、标本玻片制备

3.1 保存样本离心，加新鲜固定液，配制适当浓度滴到载玻片上，观察标本质量（10 Cell/HP）

3.2 室温（20℃～37℃）2×SSC（Ph 7.0）液中浸泡2 min（老化）

3.3 依次室温（20℃～37℃）70%、85％、100％乙醇中浸泡2 min（脱水）待干，

3.4 适当区域滴加探针液6 ul ，18×18 盖玻片封盖，封片胶密闭封片无气泡、无空隙；待干

四、变性杂交

4.1 杂交仪**程序75℃变性1～2min，37℃杂交不小于16 h（过程中保持湿度，湿条＋润湿纱布块）

五、洗片

5.1 小心去掉盖玻片和封片胶

5.2 在75℃水浴箱中，玻片浸泡在0.4×SSC、0.3％NP40(pH7.0)（72℃+/-1℃）液中2 min

5.3 晾干，在2×SSC、0.1％NP40（pH7.0）室温中浸泡30s（背景信号好坏）

5.4 晾干，加6ul DAPI antifade 到载玻片上，18×18盖玻片

5.5 暗环境，荧光显微镜观察

制片完成后，在显微镜下观察不同颜色的荧光探针，并在专业的FISH图像处理软件（http://www.naturegene.cn/naturegene_Product_17737660.html）中采集图像和进行后期的图像分析处理。