荧光原位杂交(FISH)样本玻片制备

日期:2020-09-20 13:23
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摘要: FISH试剂 0.075M KCl (2月一次) 固定液(甲醇:冰醋酸=3 : 1) (一周一次) 2×SSC (PH=7.0,一周一次) 2×SSC 0.1%NP40 (PH=7.0,一周一次) 0.4*SSC 0.3%NP40 (PH=7.0,一周一次) 70%、85%、100%乙醇 (一周...


FISH试剂

0.075M KCl                                                    (2月一次)

固定液(甲醇:冰醋酸=3 1                    (一周一次)

2×SSC                                                          (PH=7.0,一周一次)

2×SSC 0.1%NP40                                         (PH=7.0,一周一次)

0.4*SSC 0.3%NP40                                       (PH=7.0,一周一次)

70%、85%、100%乙醇                                (一周一次)


样本玻片制备步骤

一、采集样本

1.1 外周血不少于2ml×2WBC计数大于20×109),EDTA抗凝,4℃保存小于3

1.2 骨髓不少于1ml×2BM增生明显活跃),肝素抗凝,保存时间小于3天,4℃保存


二、标本前期处理

2.1 .样本2500R离心8 min,让血细胞沉淀,去上清,留沉淀

2.2 沉淀+ 0.075M KCl混合(1ml样本 + 8ml KCl),吸管吹匀,水浴箱37℃低渗 30 min

2.3 取出按样本:固定液=101比例加固定液,固定液不的超过1 ml

2.4 混匀,吹散细胞,1800R 离心 8 min

2.5 去上清,留沉淀,加510ml 固定液(不得超过10ml),混匀,静置10 min(吸去底部絮状沉淀)

2.6 重复2.42.5步骤2次,(外周血23次,骨髓34次)

2.7 去上清液,加少许固定液12min 4℃保存12月(保存样本)


三、标本玻片制备

3.1 保存样本离心,加新鲜固定液,配制适当浓度滴到载玻片上,观察标本质量(10 Cell/HP

3.2 室温(20℃~37℃)2×SSCPh 7.0)液中浸泡2 min(老化)

3.3 依次室温(20℃~37℃)70%85%、100%乙醇中浸泡2 min(脱水)待干,

3.4 适当区域滴加探针液6 ul 18×18 盖玻片封盖,封片胶密闭封片无气泡、无空隙;待干


四、变性杂交

4.1 杂交仪**程序75℃变性12min37℃杂交不小于16 h(过程中保持湿度,湿条+润湿纱布块)


五、洗片

5.1 小心去掉盖玻片和封片胶

5.2 75℃水浴箱中,玻片浸泡在0.4×SSC0.3NP40(pH7.0)72+/-1℃)液中2 min

5.3 晾干,在2×SSC0.1NP40pH7.0)室温中浸泡30s(背景信号好坏)

5.4 晾干,加6ul DAPI antifade 到载玻片上,18×18盖玻片

5.5 暗环境,荧光显微镜观察


制片完成后,在显微镜下观察不同颜色的荧光探针,并在专业的FISH图像处理软件(http://www.naturegene.cn/naturegene_Product_17737660.html)中采集图像和进行后期的图像分析处理。